腫瘤源的細(xì)胞外小囊泡（TEVs, Tumor-derived extracellular vesicles）通過(guò)在親代細(xì)胞和受體細(xì)胞之間傳遞功能性生物分子，從而在癌癥的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

TEVs對(duì)于其他器官的影響已被不斷報(bào)道，這種效果主要是因?yàn)楸话獾纳锘钚晕镔|(zhì)，包括脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)、核酸和代謝物。一些研究解釋了TEVs的功能，包括腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移生態(tài)位的形成和影響免疫平衡。TEVs的分離對(duì)研究其生理功能及診斷和治療應(yīng)用具有重要意義。

近期，來(lái)自武漢大學(xué)的科研人員以小鼠原發(fā)性乳腺腫瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，提出了一種高效分離TEVs的新方案。這一方案通過(guò)差速超速離心法，僅用時(shí)4小時(shí)，就能從復(fù)雜的腫瘤細(xì)胞中提取出高純度的TEVs。這不僅為深入研究TEVs的生理功能提供了可能，也為癌癥的診斷和治療開(kāi)辟了新的思路：

該方案包括了組織分離、酶消化和離心三步，該方案同樣適用于從其他類型的實(shí)體瘤中提取EVs。

申明：執(zhí)行任何實(shí)驗(yàn)方案都需要遵守當(dāng)?shù)貦C(jī)構(gòu)關(guān)于實(shí)驗(yàn)室安全和倫理的指導(dǎo)方針。

選對(duì)離心方案：差速超速離心！TEVs 的“提純術(shù)”

在將腫瘤細(xì)胞組織切片、分離和酶消化之后，對(duì)于關(guān)鍵分離步驟——離心部分的操作，研究人員用時(shí)4小時(shí)，通過(guò)多步差速離心的方式，依靠TEVs與雜質(zhì)顆粒在大小和密度等不同參數(shù)的差異，將其分離出來(lái)。

為了獲得較高純度的TEVs并盡量提高收率，研究人員在離心操作過(guò)程中還分享了一些實(shí)用技巧和建議：

第一步離心：Eppendorf 5810R離心機(jī)，500 x g，20 min，4 ℃。

此步主要進(jìn)行組織顆粒及細(xì)胞的沉淀分離，保留上清液。

第二步離心：Eppendorf 5810R離心機(jī)，3,000 x g，20 min，4 ℃。

此步目的是進(jìn)一步去除組織碎片，保留上清液。

第三步離心：Sigma 1-14K微型離心機(jī)，10,000 x g，30 min，4 ℃。

此步的目的是去除較大細(xì)胞微泡（MVs）并富集小的TEVs，保留上清液。

• 取上清的操作要盡可能地快，以避免細(xì)胞沉淀再擴(kuò)散。

• 可以在沉淀上方留下少量上清，以避免干擾上清。

• 取出的上清液需要用0.22µm孔徑的針頭濾器過(guò)濾，此操作中控制擠壓過(guò)濾器的力度非常重要，因?yàn)橛昧μ罂赡軙?huì)導(dǎo)致也MVs穿過(guò)過(guò)濾器。

第四步離心：Hitachi Himac CP80WX超速離心機(jī)，P50A3轉(zhuǎn)頭，110,000 x g， 70 min，4 ℃。

此步是為了收集小的TEVs，保留沉淀。

• 選用新的超速離心管，在裝樣之前，建議先用清水清洗離心管后再用ddH2O充分沖洗，因?yàn)楣茏觾?nèi)部的涂層會(huì)粘附TEVs并阻礙其沉淀。

• 可選操作：如果需要進(jìn)一步純化TEVs顆粒，可以將TEVs顆粒在2.5 mL PBS中重懸，然后將樣品緩慢加到0.5 mL蔗糖/重水墊液層之上，然后110,000 x g， 70 min，4 ℃離心。

第五步離心：Hitachi Himac CP80WX超速離心機(jī)，P50A3轉(zhuǎn)頭，110,000 x g， 70 min，4 ℃。

此步是將前步沉淀在1 mL PBS中重懸后再次離心，將TEVs顆粒進(jìn)一步純化，保留沉淀。

• 離心后吸除上清時(shí)，建議在TEVs沉淀的對(duì)面進(jìn)行操作，避免影響TEV沉淀。

經(jīng)過(guò)上述操作之后，將最后所得的TEVs沉淀在冰冷的無(wú)菌PBS緩沖液中重懸，即可作為透射電鏡、免疫印跡和納米流式細(xì)胞術(shù)的測(cè)試樣品，可以對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定和研究。

差速離心法分離TEVs是一種高效且高產(chǎn)的方法。然而與密度梯度離心、尺寸排阻層析、免疫沉淀和超濾等其他分離技術(shù)相比，該方法也存在一定的局限性。

1. 差速離心操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但并不適合一些痕量和珍貴樣品的研究。

2. 對(duì)于組織樣品，使用過(guò)濾裝置進(jìn)行過(guò)濾操作是必不可少的，因?yàn)橄M織的成分包括一些復(fù)雜的囊泡干擾物，比如蛋白聚合物、細(xì)胞碎片和微生物。這些物質(zhì)與TEVs尺寸相近，如果不進(jìn)行過(guò)濾，將嚴(yán)重干擾TEVs后續(xù)的鑒定和生物學(xué)功能的研究。

3. 過(guò)濾操作也會(huì)影響TEVs的濃度，導(dǎo)致其產(chǎn)量下降。

本文所描述的EV分離方案針對(duì)乳腺癌（BC）細(xì)胞異位移植瘤進(jìn)行了優(yōu)化，并將小鼠三陰BC（4T1）異位移植瘤作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行了展示，在操作過(guò)程中也分享了一些可以獲得高純度EV和使收率最大化的實(shí)用技巧，對(duì)于其他類型的癌細(xì)胞異位移植瘤模型也具有參考價(jià)值。

CP-NX 系列超速離心機(jī)助力外泌體純化

日立HitachiCP-NX 系列超速離心機(jī)（本文 CP80WX 是上一代機(jī)型）憑借其出色的性能，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡的精細(xì)純化。

隨著科研技術(shù)的不斷進(jìn)步和腫瘤研究的深入發(fā)展，相信 Hitachi 超速離心機(jī)將在未來(lái)的癌癥診斷和治療中發(fā)揮更加重要的作用。